蛋白质检测方法（蛋白质浓度测定常用的三种方法）

蛋白质检验方法（蛋白质浓度测定常见的三种方法）测定蛋白质浓度的方法有很多，科研工作者普遍应用的方法例如紫外线消化吸收法，双缩脲法，BCA方法，Lowry法，考马斯亮蓝法，凯氏定氮法这些 ，今日我以UV法，BCA法，考马斯亮蓝法，在其中的三种方法的测定蛋白质浓度的原理、优点和缺点、实际操作及其常见问题做详解。

 

蛋白质检验方法（蛋白质浓度测定常见的三种方法）

 

UV法

这类方法是在280nm光波长，立即检测蛋白质。挑选Warburg 公式计算，分光光度计能够立即显示信息出试品的浓度，或是是挑选相对的计算方法，将吸光度值变换为试品浓度。蛋白质测定全过程比较简单，先检测空缺液，随后立即检测蛋白质 质。进而看起来結果很不稳定。蛋白质立即定量分析方法，合适检测较纯粹、成份相对性单一的蛋白质。紫外线立即定量分析法相针对酶活性测定而言，速度更快，实际操作简易；可是非常容易受 到平行面化学物质的影响，如DNA的影响；此外敏感性低，规定蛋白质的浓度较高。

（1）简单经验公式定律蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor

（2）精准测算根据测算OD280/OD260的比率，随后查询表获得校正因子F，再根据以下计算公式最后結果：

蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D

在其中d为测定OD值比色计杯的薄厚

D为水溶液的稀释倍数

 

BCA法

原理BCA（bicinchonininc acid）与二价碘离子的硫代硫酸钠等别的实验试剂构成的实验试剂混和一起即变成豆绿色，即 BCA 工作中实验试剂。在偏碱标准下，BCA 与蛋白质融合时，蛋白质将 Cu2 复原为 Cu ，工作中实验试剂由原先的iPhone翠绿色变成蓝紫色一氧化氮合酶。562 nm 下其吸光抗压强度与蛋白质浓度正相关。

BCA 蛋白质浓度测定检测试剂盒，Abbkine的蛋白质定量分析检测试剂盒（BCA法）出示一个简易，便捷，兼容除污剂的方法，精确定量分析总蛋白。

成份实验试剂 A100 mL实验试剂 B2 mL规范蛋白质（BSA）1 mL×2，1 mg/mL

储存标准运送溫度：室内温度（规范蛋白质 4～8 ℃ 运送）

储存溫度：室内温度（规范蛋白质 -20 ℃ 储存）

合理日期：12 个月

应用方法

 

方法一：96 填料

1. 配置 BCA 切削液：依据标准物质和试品总数，按 50 容积实验试剂 A，1 容积实验试剂 B 配置适当 BCA 切削液。充足搅拌。

2. 将蛋白质标准物质按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 添加 96 填料的蛋白质标准物质孔内。加杀菌双蒸水补充到 10 μL。取 10 μL 被测试品添加 96 填料的被测试品孔内。每一个测定要做 2～3 个平行面。

3. 向待测试品孔和蛋白质标准物质孔中各添加 200 μL BCA 切削液（即试品与切削液的容积比为 1:20），搅拌。

4. 37 ℃ 温浴 30 min。制冷至室内温度。

5. 酶标仪 562 nm 光波长下测定OD值。

6. 制做标曲。从标曲怎求出试品浓度。

蛋白质浓度测定常见的三种方法（详细说明）
方法二：试管婴儿法

1. 配置切削液：依据标准物质和试品总数，按 50 容积实验试剂 A，1 容积实验试剂 B 配置适当 BCA 切削液，充足搅拌。切削液配置的量要与测定常用的比色计杯相匹配。每一个测定要做 2～3 个平行面。本处例举的比色计管理体系常用的是 0.5 mL 的比色计杯。如比色计杯规格型号不一样，管理体系必须变大到试验将选用的比色计杯精确读值所必须的容积。

2. BSA 标准物质和试品的提前准备：试品自来水或其他不影响显色反应的缓冲溶液配置，使待测定的浓度坐落于标曲的线形一部分。每一个反映提前准备 3 个平行面测定。标曲一般 5~6 个点就可以。依据试品的估算浓度明确各点的实际浓度。稀释液 BSA 时能够自来水或与试品一致的水溶液。如待测试品的浓度约为 200 μg/mL，可按住表的顺序添加 BSA 标准物质、试品及 BCA 切削液。

3. 加入适量容积的规范蛋白质，以蛋白液：切削液=1:20 的占比搅拌。37 ℃ 温浴 30 min。制冷至室内温度。

4. 将试品与标准物质在 562 nm 光波长下测定OD值。

蛋白质浓度测定常见的三种方法（详细说明）
考马斯亮蓝法

试验原理考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue) 法测定蛋白质浓度，是运用蛋白质―染剂融合的原理，定量分析测定少量蛋白质浓度迅速、灵巧的方法。这类蛋白质测定法具备超出别的几类方法的突显优势，因此已经获得普遍的运用。现阶段，这一方法是也敏感度最大的蛋白质测定法之一。

考马斯亮蓝 G-250 染剂，在酸性溶液中与蛋白质融合，使染剂的较大 消化吸收峰 (lmax) 的部位，由 465 nm 变成 595 nm，水溶液的色调也由黑棕色变成深蓝色。根据测定 595 nm 处吸光的增加率得知两者之间融合蛋白质的量。研究发现，染剂主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 (尤其是精氨酸) 和脂环氨基酸残基紧密结合。

突显优势（1）敏感度高，据统计比 Lowry 法约高四倍，其最少蛋白质检验量达到 1 mg。这是由于蛋白质与染剂融合后造成的色调发生变化，蛋白质-染剂一氧化氮合酶有高些的消光系数，因此吸光值随蛋白质浓度的转变比 Lowry 法要大的多。

（2）测定迅速、简单，只要加一种实验试剂。进行一个试品的测定，只必须 5 分鐘上下。因为染剂与蛋白质融合的全过程，大概要是 2 分鐘就可以进行，其色调能够在 1 钟头内长期保持，且在 5 分鐘至 20 分鐘中间，色调的可靠性最好是。因此彻底无需像 Lowry 法那般费时间和必须严苛地控制时间。

（3）影响化学物质少。如影响 Lowry 法的 K 、Na 、Mg2 正离子、Tris 缓冲溶液、糖和绵白糖、凡士林、巯基乙醇、EDTA 等均不影响此测定法。

缺陷（1）因为各种各样蛋白质中的精氨酸和脂环碳水化合物的成分不一样，因而考马斯亮蓝染色法用以不一样蛋白质测定时有很大的误差，在制做标曲时一般采用 g-血蛋白为规范蛋白质，以降低这些方面的误差。

（2）仍有一些化学物质影响此方法的测定，关键的影响化学物质有：除污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 (SDS) 等。

实验试剂与器械1、实验试剂考马斯亮蓝实验试剂：

考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶解 50 mL 95% 酒精中，添加 100 mL 85% 硫酸铵，用纯净水稀释液至 1000 mL。

2、规范和被测蛋白质水溶液（1）规范蛋白质水溶液

结晶体牛血清蛋白，事先经少量凯氏定氮法测定蛋白质氮成分，依据其纯净度用 0.15 mol/L NaCl 配置成 1 mg/mL 蛋白质水溶液。

（2）被测蛋白质水溶液。人血清蛋白，应用前要 0.15 mol/L NaCl 稀释液 200 倍。

3、器械试管婴儿 1.5×15 cm（×6），试管架，容量瓶管 0.5 mL（×2）;1 mL（×2）;5 mL（×1）；恒温水浴槽；光度计。

实际操作方法一、制做标曲取 7 支试管婴儿，按住表平行面实际操作。

混匀，1 h 内以 0 号管为空白试验，在 595 nm 处比色计。

绘图标曲：以 A595 nm 为纵坐标，规范蛋白质成分为横坐标轴，在坐标纸上绘图标曲。

 

二、不明试品蛋白质浓度测定测定方法跟上面一样，取适合的不明试品容积，使其测定值在标曲的平行线范畴内。依据所测定的 A595 nm 值，在标曲上查出来其等同于规范蛋白质的量，进而测算出不明试品的蛋白质浓度（mg/mL）。

常见问题（1）在实验试剂添加后的 5-20 min 内测定吸光，由于在这段时间内色调是最平稳的。

（2）测定中，蛋白质-染剂一氧化氮合酶会出现一小部分吸咐于比色计杯内壁，测定完后能用酒精将深蓝色的比色计杯洗干净。

（3）运用考马斯亮蓝法分析蛋白质务必要把握好光度计的恰当应用，反复测定OD值时，比色计杯一定要清洗整洁，制做蛋白质标曲的情况下，蛋白质标准物质最好是是以低浓度到高浓度测定，避免 出现偏差的原因。